这是一个在路上的真实故事，一段年轻的格瓦拉成长的旅程。
1952年1月4日，23岁的格瓦拉和朋友艾伯特骑着摩托车从阿根廷出发，历时8个月，穿越南美洲，行程2万多公里。那时他还不是后来被同志们亲热呼唤的“切”，而是一个家境优裕、正主攻麻风学的医学院学生“恩尼斯托”，临行时还没有结束三门课的毕业考试。青年格瓦拉，是一名狂热的橄榄球爱好者，也是个不时发作的哮喘病患者。伙伴艾伯特，29岁的生物化学家，一个风趣好玩的家伙，有点世故有点油滑，自命“游荡的化学家”，这个角色使影片充满了活泼和戏剧性。两个朋友的坐骑是一辆诺顿（Norton）500型的摩托车，被格瓦拉家人戏谑地称为“女人车”，他却叫它“强壮者”。这两个精神梦想家跌跌撞撞地驶出了布宜诺斯艾利斯，面对广袤的美洲大陆，他们满怀激情地要去探索世界、追寻梦想。正如片头艾伯特边收拾行囊边哼唱的：去灵魂带我们去的地方！
《摩托日记》并非以革命为主题，而是一部有关成长的公路电影。不少主人公在原野上驰往往天际的镜头异常壮丽，以格瓦拉的日记旁白为线索，而视角却是客观、纪录性的，真实地还原了格瓦拉作为一名热爱土地和生活的青年之本色面貌，淳朴、真诚，不谙世事又对复杂的世界充满了好奇、勇敢与热情。这又是他不同于处事圆滑的同伴艾伯特，亦不同于大多数常人的不凡之处。一路上他和同伴穿越了广阔瑰丽的美洲大陆，也经历了不断认识自我、认识世界，摸索探寻理想的曲折历程。
与格瓦拉的未婚妻道别后，旅途伊始充满了浪漫色彩。天际的雪山融入云端，茫茫大草原，牛羊成群，宁谧如诗。阿根廷的安第斯山脉，雨季的亚马逊河大诗人帕斯在着名长诗《太阳石》中所热烈歌咏的秘鲁高峰……乡间音乐会的喧闹欢快，把酒豪饮的农庄男人，热烈多情的拉丁女人……天地间人世斑斓的风景，他们一一尽收眼底。格瓦拉欣悦于自己与土地更接近了。
风餐露宿是沿途经常有的事。“强壮者”一再抛锚，终于报废后只好当作一堆废铁折卖了。不得已他们徒步、搭车、乘船，没钱了沿途行医，借宿于穷苦的底层人民。一开始，他们并不爽快地挤住在工人的棚窝里，因为他们是医生，是从上流社会的宅邸和舞会上离开的有身份的人。可越多接触到各行各业普通的人们，两位年轻人的胸怀越开阔，逐渐关心起社会的现实。在智利的马奇古矿山过夜，他们与一对矿工夫妇彻夜长谈，格瓦拉深深同情矿工被压迫的命运，而因为他们是共产党员，因此所受的迫害愈甚。得知他们的儿子也旅行去了，接着那位母亲说出了令他动容的话：你们旅行是为了旅行，而我们儿子是为了寻找工作。格瓦拉的日记里说，这是我一生最冷的晚上。他一路珍藏着未婚妻临行时给他的15块美金，哪怕是哮喘病发作时也舍不得花了医治，而这次他悄悄地送给了这对矿工夫妇。
他们目睹了众多无名的苦难与不公。养病牛的牧人，瘸腿的洗车工，和他无钱医治、孤寂赴死的老母亲；原住民印加人懂得医学、天文学和数学，却为操武器的西班牙殖民者奴役。
“这条河病了。”格瓦拉凝视着窗外。在秘鲁的圣帕堡，他们摆渡前往河流对岸被隔离的麻风病人区，拒戴手套并毫不避嫌地主动握住病人的手。在小木屋里，格瓦拉耐心劝说一名绝望的女子动手术。谈到他自己的哮喘，他说：我会说的第一个词是“注射剂”……手术后，他又彻夜陪坐在她床前安慰。他们和麻风病人一起盖房子，击鼓，踢足球，像兄弟般鼓舞着病人们重生的信念。
在为他们送行的晚会上，人们也为格瓦拉庆祝生日。“我们拉丁美洲人应该团结起来。”他的慷慨陈词预示着他日渐孕育的梦想：为美洲大陆的人们解放自由而斗争。
旅途结束时格瓦拉在日记里写道：这不是一个英雄的故事，这是两个生命相遇走在一起，有共同梦想的经历。我们的见识狭隘吗？也许。可这次旅行后，美洲大陆改变了。我不再是我，从前的我。
之后他是切？格瓦拉，一个在颠簸的路上走向非凡人生的赤子。这个人用双脚丈量了土地，并立志要改变整个大陆的命运。如此广博胸怀的人物，在途中他已把自己抛给了民众，抛给了大地。
影片的结尾在字幕中，又穿插重现着主人公在旅途中拍摄的黑白旧照，镜头前的普通人：工人、农民、孩童、牧人、卖水果的女人……如第三只永不厌倦的眼睛，注视着尘封的历史中无数鲜活的生命，艺术使他们不再被湮没。青春和理想，也在这部《摩托日记》的颠簸中永远定格。
